[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Biała biotechnologia (ang. white biotechnology) to biotechnologia zajmująca się wykorzystaniem systemów biologicznych w przemyśle i ochronie środowiska. Ten rodzaj biotechnologii jest oparty w głównej mierze na bioprocesach i biokatalizie. Dzięki wykorzystaniu komórek pleśni, bakterii, drożdży oraz enzymów z nich pochodzących, można poddawać przekształceniom produkty rolne i uzyskiwać z nich leki, chemikalia, materiały polimerowe, czynniki energetyczne, dodatki konsumpcyjne itd. Biała biotechnologia jest tą, która sprawia, że procesy przemysłowe są bardziej przyjazne środowisku i mniej kosztowne, poprzez zużycie energii, oszczędność surowców, redukcje odpadów do minimum, a środowisko naturalne nie podlega skażeniu.
Zielona biotechnologia (ang. green biotechnology), nazywana też agrobiotechnologią, zajmuje się aspektami związanymi z rolnictwem, rozwiązaniami stosowanymi w celach spożywczych i niespożywczych. Uściślając termin zielonej biotechnologii, trzeba podkreślić, że głównym obiektem zainteresowania są tutaj rośliny, a nie jakby mogło się wydawać również zwierzęta. Ten rodzaj biotechnologii to głównie wykorzystywanie wiedzy o roślinach do zaspokajania potrzeb człowieka. Do roślin, które są wykorzystywane w agrobiotechnologii należy zaliczyć soję, bawełnę, rzepak i kukurydzę. Te cztery rośliny zostały wybrane nieprzypadkowo, a o ich wyborze zdecydowały dwie zasadnicze cechy, takie jak odporność na herbicydy nieselektywne oraz na działanie szkodników owadzich. Wśród wymienionych roślin, które stanowią tylko trzon roślin genetycznie modyfikowanych, można wyodrębnić kilka typów transformacji. W przeważającej mierze, bo aż w 80% rośliny posiadają gen lub geny odporności na działanie herbicydów, 12% roślin genetycznie modyfikowanych posiada sztucznie wprowadzony gen odporności na gąsienice Lepidoptera, o symbolu Bt (Bacillus thuringiensis). Ostatnie 8% roślin GM jednocześnie jest odporna na herbicydy i zawiera gen Bt. Rozwój zielonej biotechnologii właśnie w takim kierunku, gwarantuje zmniejszenia zanieczyszczenia środowiska poprzez zmniejszenie stosowania środków ochrony roślin.
Czerwona biotechnologia (ang. red biotechnology) to biotechnologia, której głównym obszarem zainteresowania jest służba zdrowia. Naukowcy uważają, że medycyna przyszłości będzie się w dużej mierze opierać na diagnostyce molekularnej. Jednym z pierwszych badań jakie zleci lekarz, będzie tak jak teraz badanie krwi, ale już na poziomie molekularnym. Badaniu nie będzie poddawany cały genom, ale jego fragment mający wpływ na chorobę. Takie rozwiązanie na pewno przyczyniłoby się do większej skuteczności leczenia, z czym wiązałyby się korzyści ekonomiczne. Obecnie możemy obserwować jak większość biofarmaceutyków jest wytwarzanych za pomocą rekombinowanych bakterii E. coli czy drożdży S. cerevisiae. Rekombinowane są również linie komórkowe organizmów wyższych oraz tworzone hybrydowe kultury międzygatunkowe jak to ma miejsce w przypadku przeciwciał monoklonalnych, które są hybrydą limfocytu B i komórek szpiczaka gwarantującego hybrydzie nieśmiertelność. Udało się już w taki biotechnologiczny sposób uzyskać cenne grupy leków m.in. interferony, interleukiny, hematopoetyczne czynniki wzrostu, czynniki martwicy nowotworów, preparaty trombolityczne, czynniki krzepnięcia krwi, rekombinowane hormony, czy wspomniane wyżej przeciwciała monoklonalne. Wykorzystanie technologii rekombinacji DNA w celu uzyskania ludzkich białek w znaczący sposób podniosło poziom bezpieczeństwa stosowanych leków, które z pewnością nie wywołają zapalenia wątroby typu B, HIV, choroby Creuztfelda-Jakoba, jak to miało miejsce w przypadku białek izolowanych z naturalnych źródeł.
Rybozymy - Katalityczne cząsteczki RNA zdolne do degradacji / ligacji własnego szkieletu fosfodiestrowego.
Zidentyfikowano 9 typów naturalnych rybozymów, które można podzielić na 3 grupy:
- rybozymy niskocząsteczkowe (hammerhead, hairpin, delta, VS)
- rybozymy wielkocząsteczkowe (introny grupy I i II, RNaza P, snRNA U2 i U6)
- rybosom
Mechanizm katalityczny rybozymów:
Rybozym rozpoznaje sekwencję komplementarną docelowego mRNA poprzez hybrydyzację typu Watsona – Cricka. Po przyjęciu aktywnej konformacji w kompleksie dochodzi do degradacji wiązania fosfodiestrowego w nici mRNA. Tworzy się kompleks rybozymu z produktami degradacji. Kompleks ten ulega rozdysocjowaniu, dając produkty reakcji, oraz uwolniony rybozym zdolny do następnego cyklu katalizy.
Enzymy restrykcyjne-klasy:
Klasa I – białka multimeryczne wymagające jako kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg2+
● enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości od niej nacina obie nici DNA, nie
uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA
● działają jako restryktazy i kodyfikacyjne metylazy
● substrat to dwuniciowy DNA zawierający zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów
Klasa II – białka proste, występują w postaci dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane Mg2+
● enzymy te znalazły największe zastosowanie w biologii molekularnej
● odpowiadające im metylazy występują jako oddzielne białka monomeryczne
● substratem jest dwuniciowy DNA zawierający kilku nukleotydową sekwencje specyficznie
rozpoznawaną przez dany enzym
● cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)
● większość enzymów rozpoznaje palindromowe sekwencje (posiadające oś symetrii) cztero-,
sześcio-, lub ośmionukleotydowe. W wyniku ich cięcia mogą powstać dwa rodzaje końców
tzw „lepkie” i „tępe” końce
Klasa III – aktywowane przez jony Mg2+ i ATP, czasem potrzebna jest S-adenylometionina.
● Aktywność restryktaz zależy także od stężenia soli (NaCl) zawartej w buforze. Niektóre enzymy wykazują maksimum aktywności przy wysokim stężeniu soli (150 mM), inne przy niskim stężeniu NaCl.
Są również takie dla których stężenie soli może być skrajnie różne (0-150 mM) np. AvaI.
● Wszystkie enzymy restrykcyjne po trawieniu dwuniciowego DNA pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'.
● przecięcie dwóch nici w obrębie rozpoznanej sekwencji nie zachodzi jednocześnie,
lecz jest wynikiem dwóch niezależnych reakcji katalitycznych. Stosując odpowiednio niskie stężenie
enzymu w stosunku do stężenia DNA można uzyskać cząsteczki z tylko jedną przeciętą nicią.
Zastosowanie: Rozpoznawanie przez restryktazy specyficznej sekwencji DNA, połączone ze specyficznym cięciem, spowodowało, że wraz z ligazami DNA, używa się ich w biologii molekularnej do manipulacji fragmentów DNA.
Cechy dobrego wektora
- miejsce rozpoznawalne przez restryktazy
- możliwość namnażania w komórce gospodarza
- posiadanie markera
-pojemność,
-zdolność inkorporacji do genomu komórki docelowej,
-usunięte wszystkie geny wirulencji
Utlenianie kw. Tłuszczowych---à
Proces β-oksydacji zachodzi w matrixie u i w u . Kwasy tłuszczowe muszą najpierw w reakcji z udziałem ATP zostać zamienione w aktywny metabolit, aby mogły reagować z enzymami odpowiedzialnymi za ich dalszy metabolizm. W całym szlaku degradacji kwasów tłuszczowych jest to jedyny etap, który wymaga energii zawartej w ATP.
W obecności ATP i CoA, enzym – syntetaza acylo-CoA (tiokinaza) – katalizuje przemianę kwasu tłuszczowego w „aktywny kwas tłuszczowy”, czyli acylo-CoA. Reakcja ta związana jest z wydzieleniem jednego wysokoenergetycznego wiązania fosforanowego
Glikoliza beztlenowa- jeśli przeważają warunki beztlenowe, uniemożliwiona staje się reoksydacja NADH w łańcuchu oddechowym przez przeniesienie równoważników redukujących na tlen. Pirogronian ulega redukcji przez NADH do mleczanu w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę mleczanową. Reoksydacja NADH w reakcji powstawania mleczanu przez odtworzenie NAD potrzebnego w następnym cyklu reakcji umożliwia dalszy przebieg glikolizy w przypadku nieobecności tlenu.Przykładem komórek, które przeprowadzają wyłącznie glikolizę beztlenową są erytrocyty, ze względu na brak mitochondriów, niezbędnych do przeprowadzanie reakcji łańcucha oddechowego. Jednak w przypadku krwinek czerwonych glikoliza zachodzi z ominięciem reakcji katalizowanej przez kinazę fosfoglicerynianową. Dodatkowy enzym, jakim jest mutaza bisfosfoglicerynianowa katalizuje przekształcenie 1,3-BPG w 2,3-BPG, który ostatecznie ulega przemianie do 3-fosfoglicerynianu przy udziale fosfatazy 2,3-bisfosfoglicerynianowej.
Genom, zespół genów zawarty w pojedynczym (haploidalnym) zespole chromosomów znajdującym się w jądrze komórkowym. Organizmy diploidalne posiadają dwa genomy w jądrach swoich komórek somatycznych, pochodzące z gamety żeńskiej i męskiej, organizmy poliploidalne mogą posiadać do kilkuset genomów. Organizmy niższe często bywają haploidalne.
Genotyp (gr. γηνοσ - ród, pochodzenie + τυποσ - odbicie) – zespół genów danego osobnika warunkujących jego właściwości dziedziczne. Jest to sparowany układ alleli (często myli się go z genomem, czyli składem genetycznym podstawowego (monoploidalnego) zestawu chromosomów[1]). Można go wyrazić symbolicznie za pomocą oznaczeń aa, AA lub Aa, gdzie aa i AA oznaczają homozygotę pod względem tego genu, a Aa oznacza heterozygotę.
Polilinker (także MCS - od ang. multiple cloning site) - krótki odcinek DNA zawierający wiele miejsc rozpoznawanych przez różne enzymy restrykcyjne. Jest używany w biotechnologii, bioinżynierii i genetyce molekularnej.Nowe polilinkery wytwarza się w procesie chemicznej syntezy oligonukleotydów według zaplanowanej i przydatnej do manipulacji genetycznych sekwencji. Już istniejące polilinkery można produkować metodą amplifikacji DNA.
Polirybosom, polisom, informosom – zespół rybosomów związanych z jedną cząsteczką mRNA i prowadzących jej translację, czyli syntezę białek. Odkryte i opisane w 1963 r. przez Jonathana Warner, Paula Knopf, i Alexa Rich[1]. Polisomy mogą występować w postaci pojedynczych ziarenek w cytoplazmie, bądź systemu rybosomów przyczepionych do błon siateczki śródplazmatycznej szorstkiej (ER-g).
Operon – zbiór położonych obok siebie w genomie, wspólnie transkrybowanych i regulowanych genów[1]. W skład pojedynczego operonu wchodzą:: geny kodujące białka i enzymy (geny struktury lub też geny strukturalne),dwa odcinki DNA niekodujące białek: promotor i operator.Rodzaje operonów bakteryjnych: indukowane (kataboliczne) - produkcja enzymów jeśli substrat obecny w środowisku,ulegające represji (anaboliczne) - produkcja enzymów jeśli substancja syntetyzowana nie istnieje w komórce, podlegające regulacji pozytywnej – transkrypcja w obecności induktora, podlegające regulacji negatywnej – blokowanie transkrypcji przez wolny rep resor
miRNA (mikroRNA) – jednoniciowe cząsteczki RNA o długości ok. 21-23 nukleotydów, regulujące ekspresję innych genów. miRNA kodowane są przez genom komórki, jak normalne geny, i transkrybowane przez RNA polimerazę II, tak samo, jak mRNA. Prekursorem są niewielkie RNA, o strukturze spinki do włosów, które ulegają obróbce podobnie do siRNA. Wchodzą w skład kompleksów rybonukleoproteinowych blokujących specyficznie translację mRNA i nadają im specyficzność. W odróżnieniu od siRNA, miRNA nie posiadają 100%-owej identyczności sekwencji do docelowego mRNA. miRNA są zaangażowane w negatywną regulację ekspresji genów podczas rozwoju; ocenia sie, ze biorą udział w regulacji 30% ludzkich genów. Są mediatorami mechanizmu interferencji z translacją mRNA (RNAi).[pokaż]
snoRNA, małe jąderkowe RNA (ang. small nucleolar RNA, snoRNA) – zlokalizowane przede wszystkim w jąderku krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, które biorą udział w obróbce rRNA polegającej na modyfikacjach chemicznych nukleotydów., SnoRNA występują u eukariontów i Archaea.
Termocykler - urządzenie używane w laboratorium do przeprowadzania PCR. Urządzenie wyposażone jest w blok grzejny z otworami na próbówki (zwane tutaj peceerówkami), w których przeprowadza się reakcję. Urządzenie zapewnia zmiany temperatury bloku zgodne ze wcześniej zdefiniowanym programem i odpowiednie do efektywnego zajścia PCR. Bloki grzejne, by zmieniały swą temperaturę możliwie szybko, są zazwyczaj wyposażone w moduł Peltiera. Niektóre, bardziej zaawansowane termocyklery (np. do przeprowadzania reakcji real time PCR), mają naczynia rekacyjne chłodzone i grzane powietrzem.
Fag Lambda-Należy do fagów odpowiedzialnych za transdukcje, czyli przenoszenie informacji genetycznej jednej bakterii do drugiej przy udziale bakteriofaga. Należy do fagów łagodnych, czyli takich które nie zawsze skutkują śmiercią komórkową po namnożeniu. Może wchodzić w skład chromosomu bakteryjnego i replikować się razem z nim. Fag, który znajdzie się w takim chromosomie nazywa się profagiem. Jeśli profag odzieli się od materiału genetycznego bakterii, np. w skutek działania promieni UV lub rentgenowskich, wtedy zostaje zapoczątkowany cykl lityczny kończący się śmiercią komórki.Genom faga lambda
DNA faga występuje w dwóch postać: jako kuliste lub liniowe. W bakteriach może być kuliste lub liniowe, natomiast w wirusach tylko liniowe.Przejście od postaci liniowej do kolistej zachodzi dzięki enzymom. To one umożliwiają pęknięcie obu nici (+ i - ). Pęknięcia są zlokalizowane blisko siebie, ale nie w tym samym miejscu. Liniowe DNA ma wówczas dwa końce z jednych nici, które są komplementarne. Mówimy o lepkich końcach, które umożliwiają właśnie zmianę postaci liniowej na kulistą i na odwrót. Mają one długość do dwunastu nukleotydów. Warunkiem jest powstanie wiązań wodorowych pomiędzy końcami komplementarnymi.DNA w formie kolistej jest charakterystyczne dla fazy litycznej, natomiast liniowe dla fazy lizygenicznej
Syntaza ATP, syntetaza ATP – (EC 3.6.3.14) enzym katalizujący reakcję wytwarzania związku wysokoenergetycznego – ATP z ADP i fosforanu nieorganicznego Pi. Energia niezbędna do syntezy pochodzi z gradientu elektrochemicznego i przekształcana jest w energię wiązań chemicznych podczas transportu protonów przez syntazę ATP.
Enzym katalizuje reakcję: ADP + Pi → ATP
Synteza ATP znajduje się w wewnętrznej błonie mitochondriów, w błonach tylakoidów wewnątrz chloroplastów oraz w błonach komórkowych organizmów prokariotycznych. Enzym bierze udział w kluczowych procesach uzyskiwania energii przez organizmy żywe fosforylacji oksydacyjnej będącej głównym źródłem ATP wytwarzanego podczas oddychania komórkowego oraz fosforylacji fotosyntetycznej będącej źródłem ATP powstającego w fazie jasnej fotosyntezy.
Funkcja: Wewnątrz błony mitochondrialnej (u eukariontów) lub w błonie komórkowej (u bakterii) następuje utlenianie NADH do NAD+. Uwolnione elektrony uczestniczą w łańcuchu oddechowym, aby napędzić przeniesienie protonów w poprzek błony przez składające się na ten łańcuch odpowiednie przenośniki (pompy). W chloroplastach i błonach fotosyntetyzujących organizmów prokariotycznych protony przenoszone są dzięki energii uzyskanej poprzez pochłonięcie kwantów światła przez odpowiednie kompleksy.ATP wytwarzane jest z ADP i Pi (reszty ortofosforanowej) w wyniku działania syntazy ATP. Rotacja jej odpowiedniego segmentu umożliwia syntezę ATP. Energia niezbędna do syntezy dostarczana jest przez gradient elektrochemiczny.
Budowa: Ze względu na miejsce występowania wyróżnia się trzy podstawowe kompleksy syntazy ATP.
Są to:
Syntaza ATP mitochondrialna określana jako FoF1 lub MFoF1
Syntaza ATP chloroplastowa określana jako CFoF1
Syntaza ATP prokariotyczna
Wszystkie trzy syntazy ATP zaliczane są do grupy F-ATPaz i moją zbliżona budowę. Każda z nich składa się z dwóch domen. Pierwsza z nich – Fo – jest białkiem wewnątrzbłonowym tworzącym kanał jonowy dla jonów H+. Druga domena jest właściwą syntazą składająca się z kilkunastu polipeptydów tworzących kulista strukturę o średnicy ok. 100 Å.
Modyfikacja potranslacyjna jest to modyfikacja białka po jego translacji. Może ona wpływać na właściwości chemiczne i fizyczne białka, jego stabilność i aktywność, a zatem na jego funkcję.
Do modyfikacji translacyjnych zaliczają się:
Obróbka proteolityczna - proteazy usuwają zbędne fragmenty
aktywacja białka poprzez usunięcie zbędnych fragmentów
usunięcie sekwencji liderowych
splicing polipeptydowy - usunięcie fragmentów ze środka
usunięcie pierwszych podstawników
N-acetylacja, N-metylacja, N-formylacja - dołączenie grupy acetylowej, metylowej i metioniny
Hydroksylacja - dołączenie grupy hydroksylowej -OH
Fosforylacja - aktywacja białka przez dołączenie grupy fosforylowej
Defosforylacja - dezaktywacja przez odłączenie grupy fosforylowej
Polirybozylacja - dołączenie adeniny
dołączenie lipidów i metali
Glikozylacja - przyłączenie reszt cukrowych do białka
Ubikwitynacja - przyłączenie ubikwityny i późniejsza degradacja białka
iblioteka genomowa (też: bank genów, bank genomowy) – to kolekcja klonów (zazwyczaj bakterii), która jako całość zawiera co najmniej jedną kopię każdej sekwencji DNA obecnej w genomie organizmu, którego bibliotekę genomową utworzono.
Powstaje przez pocięcie całego genomu danego organizmu enzymami restrykcyjnymi, a następnie połączenie powstałych w ten sposób fragmentów DNA z wektorami (np. plazmidami lub kosmidami), tak że każdy wektor zawiera jeden, losowo wybrany fragment. Wektory te następnie wprowadza się do komórek bakteryjnych (np. bakterii Escherichia coli) – każda bakteria pobiera jeden wektor, a więc zawiera jeden fragment oryginalnego genomu. Taka bakteria, namnażając się, tworzy klon bakteryjny zawierający ten fragment. Tylko niektóre klony zawierają geny, część zawiera tylko fragmenty genów, większość sekwencje niekodujące. Fragmenty DNA niesione przez dwa klony mogą nakładać się na siebie, gdyż powstały przez losowe cięcie wielu kopii oryginalnego genomu. Biblioteka genomowa powinna być odpowiednio duża, aby prawdopodobieństwo, że każdy fragment oryginalnego genomu jest w niej obecny, wynosiło co najmniej 99%.
KATABOLIZM jest to proces rozpadu złożonych związków organicznych na związki prostsze o znacznie mniejszych zasobach energetycznych. W tych przemianach produkty znajdują się na niższym poziomie energetycznym niż substraty. Najważniejszym procesem katabolicznym jest oddychanie w czasie, którego utlenianie cukrów prowadzi do powstania dwutlenku węgla i wody z równoczesnym uwalnianiem energii zmagazynowanej w wysokoenergetycznych wiązaniach chemicznych.
Przykłady procesów katabolicznych:
Hydroliza tłuszczów - prowadzi do ich rozpadu na glicerol i wolne kwasy tłuszczowe,
Glikoliza - katabolizm cząsteczki, który zachodzi w cytoplazmie i polega na przekształceniu glukozy w kwas pirogronowy z jednoczesną syntezą ATP,
Katabolizm białek - zachodzi pod wpływem enzymów proteolitycznych,
Fermentacja,
Cykl Krebsa (cykl kwasu cytrynowego),
Łańcuch oddechowy,
Fotooddychanie charakterystyczne dla organizmów roślinny
Chaperony (Szaperony, Bialka opiekuńcze)
Chaperony (Szaperony, Bialka opiekuńcze) - białka oddziałujące z fałdującym się białkiem, zapobiegające nieprawidłowym wiązaniom i eliminujące błędne struktury.
Chaperony wiążą się w sposób odwracalny z nie pofałdowanym odcinkiem polipeptydu, który w innym przypadku mógłby służyć jako ośrodek agregacji lub błędnego fałdowania. Chaperony wiążą się z częściowo zwiniętymi łańcuchami umożliwiając im kontynuację zwijania się w sposób najbardziej korzystny energetycznie. Pomagają białkom w uporządkowanym tworzeniu ich struktury przestrzennej. Jedna z rodzin chaperonów nazywana jest białkami szoku cieplnego. Należą do tej rodziny min Hsp60, Hsp70, BiP, GRP75, Hsp83, Grp94.
Czym są białka, i dlaczego ulegają fałdowaniu?
Wszystkie organizmy żywe składają się z białek. One same składają się z szeregu aminokwasów, które ułożone w specyficznej kolejności, tworzą bardzo skomplikowane struktury przestrzenne. Białka są budulcem kości, mięśni, ścięgien, tworzą część naszego systemu odpornościowego (przeciwciała), stanowią sieć przekaźników komórkowych, umożliwiających zgodne działanie wszystkich komórek organizmu. Białka są biologicznymi maszynami, nanorobotami, mającymi zdolność modyfikacji innych białek oraz syntezy nowych struktur. Jednak aby mogły spełniać swoją biologiczną funkcję, muszą ulec specyficznemu ukształtowaniu. Proces tego kształtowania stanowi podstawę istnienia wszystkich organizmów żywych. Jak do tej pory nie udało się do końca wyjaśnić wszystkich aspektów tego skomplikowanego zjawiska. Złe ukształtowanie struktury białka często prowadzi do wielu chorób, w tym m.in. do choroby Alzheimera, choroby wściekłych krów czy też do choroby Parkinsona. Źle pofałdowane białka, mogą łączyć się w większe kompleksy, agregaty, które przy odpowiednim nagromadzeniu, mogą stać się niemożliwe do usunięcia i przyczynić się do powstania i rozwoju choroby. (tekst dzięki jajo).
[ Pobierz całość w formacie PDF ]Tematy
- Strona pocz±tkowa
- Ćwiczenia 1 mikroekonomia - mgr Paulina Krystosiak, Ćwiczenia mikroekonomia - mgr Paulina Krystosiak
- ĂvĂŠnements et CommĂŠmorations - Aneta Słowik, E-booki
- Żeromski Stefan - Dzienniki, SZKOŁA, Testy i sprawdziany (szkoła)
- Łukjanienko Siergiej - Lord z planety Ziemia, książki, książki
- Wilbur Smith - Odglos Gromu, ebooki
- [Ayako] Murder Princess - OVA2 [XVID 704x396] [96894436], Anime, Murder Princess [1-6][CrystalNova]
- Żymańczyk-Duda, materiały PWr, W3 - chemiczny
- (Hannah 08) - Znak ognia - Laila Brenden, Henrieta 3, Hannah (całość)
- Graham Masterton - Czternaście obliczy strachu, Do poczytania, Masterton Graham
- łańcuch 2, Poradniki związane z Rowerami
- zanotowane.pl
- doc.pisz.pl
- pdf.pisz.pl
- hafciarstwo.pev.pl